Optimización de la técnica de ELISA (Consideraciones y pasos clave)
La técnica de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) es ampliamente reconocida y utilizada en laboratorios clínicos y centros de investigación debido a su sensibilidad y especificidad para detectar antígenos y anticuerpos en muestras biológicas. Esta técnica se basa en la interacción específica entre un antígeno y un anticuerpo, seguida de la detección enzimática de este complejo.
En este artículo, le presentaremos consideraciones generales previas al desarrollo de la técnica ELISA y los pasos clave involucrados en su ejecución.
Consideraciones generales previas:
Antes de realizar la técnica ELISA, es importante que tenga en cuenta algunas consideraciones generales para garantizar resultados confiables y la seguridad en el manejo de las muestras. Y para lograrlo le recomendamos tener en cuenta los siguientes puntos
Las muestras de sangre se deben considerar como material potencialmente infeccioso y seguir las medidas de bioseguridad establecidas.
Las muestras a procesar deben estar libres de hemólisis y turbidez, además de estar correctamente rotuladas y conservadas adecuadamente.
Se deben utilizar kits con fecha de vencimiento vigente y no mezclar reactivos de diferentes lotes.
Los kits deben ser almacenados a las temperaturas recomendadas por el fabricante.
Todos los reactivos deben alcanzar la temperatura ambiente antes de iniciar el ensayo.
Es necesario mezclar suavemente los reactivos líquidos antes de su uso.
La solución de lavado concentrada debe ser diluida según las indicaciones del fabricante, utilizando agua destilada. Se recomienda homogeneizarla previamente a la dilución y conservar el remanente según las indicaciones antes de su uso. (Le recomendamos revise nuestro artículo de sobre como realizar las diluciones haciendo click aquí)
Es fundamental seguir estrictamente las instrucciones proporcionadas por el fabricante y utilizar los sueros controles y pocillos blancos indicados en el kit.
Se recomienda utilizar sueros de controles de calidad para validar el ensayo, y no utilizar como control los calibradores ya que los calibradores pueden presentar cierta subjetividad.
Se debe calcular el valor de corte y la zona gris en casos de kits cualitativos o semi-cuantitativos, mientras que en los kits cuantitativos se debe realizar una curva de calibración según las indicaciones del kit.
Se deben utilizar protocolos de trabajo adecuados para cada técnica y contar con guías de acceso rápido para diferentes metodologías (ejemplo guía rápida), la misma que debe ser realizada por el laboratorista.
Los equipos e instrumentos utilizados deben estar en buenas condiciones de operatividad, con mantenimiento preventivo y calibración adecuada.
Se deben seguir las instrucciones de uso de cada equipo, adicional llevar un registro de los mantenimientos que el servicio técnico realice al lector de Elisa.
Es útil preparar protocolos de trabajo o mapas de distribución de muestras para un control y organización rigurosos. (Plantilla de protocolo y mapa guía)
Se debe realizar y registrar el control diario de la temperatura ambiental del laboratorio, así como de los equipos de refrigeración y congelación utilizados.
Para la preparación de los controles de calidad o calibradores liofilizados, se debe utilizar agua destilada o desionizada de alta calidad.
Según la Organización Mundial de Salud en el estudio realizado para «Interpretación de las pruebas usadas para diagnosticar la infección por virus de la inmunodeficiencia humana». Recomiendan la prueba de ELISA como mecanismo de acción y estrategia alternativa para corroborar infecciones como el VIH, ya que, si los resultados resultarán reactivos, ello sería equivalente a una prueba confirmatoria de las infecciones.
Pasos clave de la técnica de ELISA
La técnica ELISA consta de cinco pasos generales, los cuales pueden variar según el método específico utilizado. Estos pasos son los siguientes:
Dispensación de muestras, controles y calibradores:
En esta etapa, se añaden las muestras biológicas, los controles positivos y negativos, así como los calibradores de concentración conocida a los pocillos de la placa de ELISA.
Adición de enzima o conjugado:
Se agrega una anti-inmunoglobulina marcada con una enzima (como fosfatasa alcalina o peroxidasa) que se unirá al complejo antígeno-anticuerpo presente en los pocillos.
Lavados con buffer:
Después de la incubación indicada en el inserto, se realiza el lavado de los pocillos para eliminar cualquier anticuerpo o antígeno no unido, reduciendo así el ruido de fondo y aumentando la especificidad del ensayo.
Adición de sustrato:
Se añade un sustrato que es modificado por la enzima unida al complejo antígeno-anticuerpo. Esto produce un producto coloreado que es proporcional a la concentración del antígeno o anticuerpo presente en la muestra.
Parada de la reacción:
Se agrega una solución para detener la reacción enzimática, lo que detiene la producción de color. Se mide la absorbancia o la intensidad de la reacción utilizando un lector de ELISA, respectivamente.
Los pasos generales pueden alterase entre lavados, ó uno de los pasos pude dividirse en dos pasos adicionales si se agrega biotina o pasos adicionales según la casa fabricante.
También hay que tomar en consideración los tiempos de incubación que se ubican antes de los lavados según los protocolos establecidos por las casas fabricantes.
A continuación, podemos observar un ejemplo de un procedimiento de Elisa.
Procedimiento de la Técnica de ELISA (Ejemplo de TSH Monobind)
Una breve guía paso a paso a manera de ejemplo de como realizar correctamente el procedimiento de la técnica de ELISA con la prueba de TSH de Monobind.
Poner a temperatura ambiente (20°C-27°C) los reactivos a utilizarse y sueros antes del ensayo.
Colocar y ordenar los pozos (calibradores, controles, muestras), según el inserto.
Pipetear 25uL de los sueros en los respectivos pozos.
Pipetear 100uL de la enzima TSH en los respectivos pozos.
Homogenizar por 20 a 30 segundos luego cubrir los pozos.
Incubar por 60 minutos a temperatura ambiente (20°C-27°C).
Vaciar los pozos, eliminar los depósitos golpeando los pozos contra el papel absorbente.
Realizar 3 lavados con 300uL de Solución de lavado a cada pozo.
Pipetear 100uL de Substrato de Trabajo en los respectivos pozos.
Incubar por 15 minutos a temperatura ambiente (20°C-27°C).
Pipetear 50uL de solución de parada.
Homogenizar por 15 a 20 segundos.
Leer los pozos con filtro primario de 450nm y secundario de 630nm.
Descargue las guías para su laboratorio aquí:
De parte de ReactLab tenemos para usted tres guías a considerar para llevar a cabo un correcto procedimiento del método de ELISA.
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por Vinicio Contreras
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