Nuevas tecnologías para el diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas

Una gran variedad de virus, bacterias, hongos y parásitos son los causantes de enfermedades infecciosas que, según estadísticas, producen alrededor de 15 millones de muertes a nivel mundial. La aparición y la recurrencia de enfermedades infecciosas ha creado grandes desafíos para la salud pública y estabilidad socioeconómica a nivel mundial. A pesar del uso de vacunas, antimicrobianos y antivirales para mitigar la mortalidad y morbilidad, su eficacia puede disminuir con la aparición de nuevos agentes patógenos, resistencia a antibióticos o por falta de concientización de prevención y medicación adecuada.[/vc_column_text]

En este orden de ideas, la selección de métodos de detección apropiados para identificar de forma rápida y precisa los patógenos es la vía más eficaz para hacer frente a este problema de salud pública, ya que, mejorar la eficacia de diagnóstico permite dar tratamientos oportunos y reducir su propagación. Y en el presente artículo se abordará el estado actual dei diagnóstico de enfermedades infecciosas, etapas de la PCR y las nuevas plataformas de PCR para biología molecular de Molbio.

Estado actual del diagnóstico de enfermedades infecciosas

Las técnicas de diagnóstico convencionales incluyen cultivos microbianos, detección de antígenos o inmunofluorescencia. En el caso de la microbiología, el tiempo de entrega de resultados es a partir de tres días y se basa principalmente en una identificación morfológica y bioquímica de las bacterias por lo que su especificidad y sensibilidad es baja o moderada dependiendo de los tipos de medios, condiciones de crecimiento e inocuidad. Por otra parte, las técnicas inmunológicas son sencillas y el tiempo de entrega del resultado es menor a un día, sin embargo, tienen altas tasas de falsos positivos y mala estabilidad térmica.

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Debido a esta problemática se han concentrado esfuerzos para el desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular, basándose en el análisis de secciones únicas de ADN o ARN del material genético de cada patógeno, lo cual proporciona una opción altamente específica, sensible y rápida para la identificación de virus, hongos, bacterias y su resistencia a antibióticos.

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La aplicación del diagnóstico molecular ofrece un progreso revolucionario en la medicina. Actualmente, existen varias técnicas moleculares para la detección de varias patologías como la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR y sus variaciones, tecnología de microarrays, secuenciación Sanger y secuenciación de nueva generación o NGS. Cabe resaltar que, la técnica más empleada es la PCR (desarrollada en 1983 por Kary Mullis) y se basa en la reacción enzimática de la polimerasa para amplificar o hacer varias copias de un segmento de ADN o ADNc definido por oligonucleótidos denominados primers que se unen de forma específica a la cadena de ADN molde.

Etapas de la PCR convencional:

El proceso de PCR se compone de tres etapas base: denaturación, annealing y extensión; en la primera etapa (denaturación) la doble hélice del material genético se separa debido al incremento de la temperatura obteniendo como resultado moléculas de una sola cadena.

En la segunda etapa (annealing), los primers se unen a la secuencia específica de las cadenas separadas para la cual fueron diseñados.

Finalmente, en la tercera etapa (extensión), la polimerasa copia la cadena de ADN usando los primers como andamio y dNTPs (desoxinucleotidos trifosfato) como “bloques de construcción”, es decir, al culminar la extensión se obtienen un duplicado del número de cadenas originales. Este proceso de tres etapas se repite por 30 a 40 ciclos, por lo tanto, se obtiene más de un billón de copias de la secuencia diana. Esta cantidad se detecta de forma cuantitativa o cualitativa para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Variaciones de la PCR:

Existen distintas variaciones de la PCR que se usan en diagnóstico de enfermedades infecciosas y estás son:

  • RT-PCR: que aplica la retrotranscripción para detectar patógenos cuyo material genético es de ARN.
  • qPCR: para observar en tiempo real la amplificación de la secuencia diana obteniendo el resultado de forma cuantitativa.
  • PCR multiplex que detecta varios genes target en un mismo ensayo, y la combinación de éstas.

Gracias a las ventajas que ofrece la biología molecular, el avance científico ha permitido el desarrollo de plataformas de diagnóstico molecular en el Punto de Atención o POC (Point of Care). Este tipo de dispositivos o pruebas POC se crearon con el fin de realizar pruebas de manera rápida y fácil en lugares cercanos al paciente para evitar el transporte de muestras o del paciente, proveer del tratamiento oportuno para la enfermedad y generar un cerco epidemiológico de forma efectiva. Debido a estas particularidades el uso de los dispositivos POC no se limita al diagnóstico cercano al paciente, sino que se puede realizar dentro de los laboratorios de referencia.

Molbio Diagnostics, la primera plataforma portátil de PCR en tiempo real del mundo

Molbio Diagnostics es una empresa originaria de la India que surgió a partir de la necesidad de resolver las problemáticas causadas por el monopolio del diagnóstico molecular en ese país. Con tan solo algunos establecimientos centralizados de diagnóstico, eran evidentes problemas como el transporte de muestras y pacientes, incremento de costos, retraso en los resultados e incluso pérdida de la viabilidad de las muestras o resultados cuestionables. Resaltando así la falta de acceso oportuno a un diagnóstico eficiente ha generado grandes problemas de salud pública no solo en la India, sino también en países en vías de desarrollo como Ecuador.

Con el afán de dar una solución a esta problemática, Molbio ha desarrollado un sistema de detección molecular POC basada en la PCR en tiempo real. Esta tecnología permite llevar el diagnóstico en todos los entornos dentro del laboratorio y fuera de éste, con el objetivo de facilitar el acceso a la detección sensible, específica y rápida del patógeno.

Molbio ofrece un amplio catálogo para la detección de enfermedades infecciosas, este sistema es independiente de infraestructura y proporciona una solución completa desde la toma de muestra, hasta la interpretación del resultado, brindando un cambio en el contexto mundial del control y gestión de enfermedades infecciosas. La tecnología de Molbio se desarrolló en base al principio de extracción y purificación de ácidos nucleicos por columnas de adsorción, mientras que, la amplificación del material genético en una variación de la PCR. A continuación, se detalla cada fundamento de la extracción y amplificación de ácidos nucleicos.

Extracción y purificación del material genético

Para la extracción y purificación del material genético, el protocolo convencional de columnas de adsorción comprende de un paso de lisis que puede ser térmica o química; como siguiente paso, el lisato se coloca en una columna que retiene los ácidos nucleicos y mediante varios ciclos de centrifugación y lavado con tampones, se eliminan las partículas que no se unen a la columna como restos celulares e impurezas.

Finalmente, los ácidos nucleicos son recuperados mediante la centrifugación con el tampón de elución. Si este proceso se realiza de forma manual puede tomar un tiempo aproximado de 40 a 50 min por muestra, requiere de equipos e implementos como microcentrífuga y termobloque dependiendo del kit comercial que se use. Además, al ser un proceso hands-on la probabilidad de contaminación o perdida de la muestra incrementa por la manipulación del personal de laboratorio durante el protocolo.

Bajo este precepto, Molbio compactó los pasos de la extracción y purificación de ácidos nucleicos desde la lisis hasta la obtención del material genético en 20 minutos y con un solo equipo. (Este proceso automatizado no requiere de mayor intervención por parte del personal de laboratorio).

Para ello, Molbio desarrolló el equipo Trueprep que realiza de manera autónoma el mismo procedimiento con ayuda de un cartucho dividido por cámaras para seccionar cada parte del proceso. Además, se basa en la tecnología de microfluidos para transportar y conectar los diferentes componentes (muestra, lisato, buffer de lavado, buffer de elución y desechos) entre sus respectivas cámaras.

En la Figura 1 se observa este cartucho de extracción, en la cámara A se coloca la muestra con el buffer de lisis, el equipo eleva la temperatura a 60° C para complementar la lisis química con la lisis térmica. A través de la válvula 1, el lisato pasa a la columna (C), una vez aquí, el equipo dispensa el buffer de lavado A y B en la cámara de reactivos (B), cada uno pasa por la columna retirando las impurezas. Finalmente, el equipo dispensa el buffer de elución y calienta la columna a 90° C para facilitar la recuperación del material genético en la cámara de elución (D).

Figura 1. Cartucho Universal para la extracción y purificación de ácidos nucleicos. (A) Cámara de muestra, (B) Cámara de reactivos, (C) Columna de adsorción, (D) Cámara de elución, (E) Desechos. (1 y 2) Válvulas

Video explicativo del funcionamiento del cartucho:
PCR en Tiempo Real

La PCR en Tiempo Real o qPCR es una variación de la PCR convencional en la que se detecta en tiempo real la cantidad de amplicones o copias de la secuencia target a través de elementos fluorescentes. Para ello, además de los elementos de la PCR convencional mencionados anteriormente, la qPCR contiene sondas específicas que se unen a la secuencia target flanqueada por los primers. La sonda contiene dos moléculas químicas en sus extremos, en el extremo 5´ se encuentra el fluoróforo (Reportero) y en el extremo 3’ un inhibidor o apagador (Quencher) del fluróforo. En la Figura 2 podrá evidenciar la sonda con las dos moléculas químicas en sus extremos.

Figura 2. Etapas del funcionamiento de la sonda en la qPCR.

Durante la fase de extensión, la polimerasa avanza por la cadena molde haciendo la copia, una vez que llega a la sección en la que está unida la sonda, la polimerasa rompe la sonda y se separa de la cadena molde para continuar con la polimerización. Cuando la sonda se rompe se separa el Quencher del Reportero para que la fluorescencia sea leída por el sistema óptico del equipo.

Una vez obtenido el material genético purificado, se realiza la qPCR o amplificación en Tiempo Real. Para esto, Molbio desarrolló la tecnología de qPCR a base de microchips (Revisar Figura 3) denominada micro PCR en Tiempo Real.

El microchip se compone de un pocillo de reacción en donde se coloca la master mix. En este pocillo tiene lugar las variaciones de temperatura para cada denaturación, annealing y extensión durante 40 ciclos, además, el microchip contiene la información de la prueba, curva estándar, lote y fecha de caducidad.

Cabe dar a conocer que la master mix del kit de diagnóstico ya está preparada y liofilizada en alícuotas para cada reacción o muestra, a diferencia de otros kits comerciales cuyos reactivos están por separado y en un solo tubo madre. El tener la master mix preparada facilita la manipulación del personal de laboratorio y reduce la probabilidad de errores humanos, además, reduce el consumo de reactivo por errores de pipeteo y por uso de controles externos en cada procesamiento. (La master mix contiene fluoróforos cuya excitación se detecta a través del sistema óptico del equipo Truelab. En este caso, Molbio usa los fluoróforos FAM, Atto565 y Atto647N).

Figura 3. Microchip para la amplificación de ácidos nucleicos. (A) Pocillo de reacción, (B) Información de la prueba, lote, fecha de caducidad, curvas estándar.

Por otra parte, la plataforma de pruebas POC de Molbio incluye todos los consumibles que se requieren para el diagnóstico desde la toma de muestra hasta la qPCR pues contiene el hisopo y medio de transporte, el buffer de lisis, los reactivos de extracción, pipetas Pasteur, el cartucho, el microchip, el microtubo con la master mix liofilizada, la micropipeta calibrada y la punta con filtro, entre otros consumibles. Esto facilita el procedimiento, la manipulación de la muestra por parte del personal, elimina la necesidad de adquisición de otros insumos y automatiza el procesamiento de muestras para una obtención de resultados de forma sensible, específica y rápida.

Para finalizar, el diagnostico oportuno y eficaz del paciente es una etapa crítica para el manejo y control de la patología y cuidado del individuo, es decir, los centros de diagnóstico son un apoyo fundamental para el equipo médico. El desarrollo de las técnicas moleculares de Molbio permite mejorar la calidad, especificidad y sensibilidad de los resultados, por ello, se evidencia un crecimiento del área diagnóstica de biología molecular dentro de los laboratorios clínicos y centros médicos. Sin embargo, en países en vías de desarrollo, este crecimiento y avance en el diagnóstico molecular se ve afectado por la centralización del servicio o falta de conocimiento sobre las demás técnicas de diagnóstico.

Con base en lo antes explicado, Molbio ofrece una plataforma asequible y portátil, con tecnología robusta y controles de calidad integrados que permiten entregar resultados confiables con un alto porcentaje de sensibilidad y especificidad en una hora. El proceso es automático, por lo tanto, la capacitación al personal es mínima, no requiere de consumibles ni conexión a un software o hardware externo.

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Alisson Sarmiento
Asesora Comercial
a.sarmiento@reactlab.com.ec

Alisson es Ingeniera en Biotecnología con experiencia en el diagnóstico molecular en los laboratorios especializados de Ecuador. Su afán es llevar al diagnóstico molecular como primera opción en los laboratorios y centros médicos del país con el objetivo de mejorar la calidad del sistema de detección de enfermedades infecciosas.

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