Laboratorista clínica realizando pruebas de inmunoensayo por ELISA

Recomendaciones para una buena técnica de inmunoensayo por ELISA

Los kits de ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) identifican y cuantifican secuencias de proteínas específicas y otros objetivos de investigación dentro de una muestra.

Para aprovechar al máximo su kit de ELISA, le proporcionamos unas recomendaciones generales para la realización idónea de sus pruebas. Estas recomendaciones se basan en años de experiencia propia y la de nuestros clientes.

En este artículo, nos enfocaremos en cada una de las fases del inmunoensayo, ya que un error en cualquiera de las fases puede afectar al resultado final.

Pocillos

La gran mayoría de los inmunoensayos por ELISA se utilizan placas de 96 pocillos de fondo plano. Es importante utilizar placas diseñadas para ELISA porque están fabricadas para mantener la coherencia, minimizar los efectos de borde y proporcionar condiciones ópticas óptimas para la recopilación de datos. Los pocillos (pozos) son el pilar fundamental para la reacción de ELISA, por lo que hay que tener ciertos cuidados con las mismos:

  1. Lleve la placa a temperatura ambiente antes de empezar el ensayo.
  2. Revisar la fecha de caducidad. En el caso de que haya pasado la fecha de caducidad, no utilice los pocillos.
  3. Una vez obtenidos los pocillos necesarios, vuelva a guardar el resto de los pocillos en la funda de aluminio y ciérrela bien.
  4. Coloque los pocillos sobre el soporte adecuado (portapocillos).
  5. Inspeccione bien las tiras por cualquier defecto que puedan tener.
  6. Limpie las tiras en caso de que tengan alguna suciedad o huellas dactilares por el exterior o fondo exterior de la misma.
  7. No es recomendable utilizar cinta por la parte inferior de los pocillos para fijar las placas debido al residuo de pegante que estos dejan.

Pipeteo

El volumen de muestra y reactivo utilizado en el análisis es muy pequeño, por lo que es extremadamente importante calibrar la pipeta con precisión y de acuerdo con el período de tiempo recomendado por el fabricante. Además de calibrar la pipeta, asegúrese de:

  1. Utilizar la punta correcta requerida para la pipeta específica.
  2. Dispensar el mismo volumen y encajar correctamente en el extremo de la pipeta.
  3. Cambiar la punta de la pipeta entre la dispensación de diferentes muestras/reactivos para evitar la contaminación de los reactivos utilizados.

Lavados

El paso de lavado se realiza para eliminar el exceso de reactivos de los pocillos que contienen los complejos unidos que están adheridos a las paredes del pocillo. Este paso se puede realizar manualmente o con un lavador de placas automático.

Independientemente del método de lavado que se utilice, el resultado final debe ser el mismo. La solución de lavado debe sumergirse en cada pocillo 3-5 veces y de remojo durante 5-30 segundos entre cada lavado, según el método de medición y el equipo utilizado. Hay que asegurarse de seguir las preparaciones recomendadas por el protocolo estipulado en el inserto.

Se debe también asegurar que el llenado de los pocillos sea uniforme y que el tiempo para cada pocillo o tirilla sea igual. Además, se debe tener precaución de no generar burbujas durante la dispensación de la solución de lavado, así como el secado correcto de los pocillos.

Sustratos

Hay dos tipos de sustratos diferentes en la metodología de ELISA. Hay sustratos de un solo componente y sustratos de dos componentes. El número de componentes depende de la prueba.

Asegúrese de verificar el uso del sustrato correcto en el protocolo o inserto de cada ensayo. Después de alcanzar la temperatura ambiente, el sustrato de un solo componente está listo para su uso. En el sustrato de dos componentes, es necesario preparar/mezclar los dos componentes, por lo general llamados A y B, para obtener el sustrato final.

Antes de utilizar el sustrato, confirme siempre que no esté contaminado, lo cual generalmente se indica mediante una coloración azul. El tiempo de incubación del sustrato es la clave del límite de detección y debe mantenerse de acuerdo con el tiempo especificado en el protocolo.

Conjugado

El conjugado utilizado para cada ensayo es diferente. Por eso, hay que asegurarse de utilizar el conjugado correcto. El almacenamiento de este componente es importante porque el almacenamiento y la caducidad de estos componentes se determinan en base a estudios de estabilidad. Cuando se requiere dilución, solo se necesita preparar la cantidad necesaria y usarla inmediatamente. Antes de dispensar los conjugados, deben estar a temperatura ambiente.

Solución de parada (STOP)

En todos los ensayos, el paso final es detener la reacción. Para esto utilizamos soluciones de diferentes ácidos en concentraciones molares.

Una vez que se añade la solución de parada al pocillo, hay un periodo de tiempo limitado para realizar la lectura del ensayo. Por lo general, este tiempo es 30 minutos, después del cual los resultados ya dejan de ser confiables.

Temperatura

Para garantizar resultados repetibles, todas las pruebas deben ejecutarse en un entorno estable. Se obtiene la temperatura estable ideal cuando hay poca o ninguna corriente de aire frio. En climas fríos, se recomienda que el laboratorio ajuste la temperatura ambiente a 20-25 °C para asegurar una respuesta adecuada.

La vibración o rotación también afectará la prueba, por lo que debe evitarse.

Todas las placas, muestras, controles, conjugados y otros reactivos solo deben usarse a temperatura ambiente para minimizar los cambios de temperatura en la placa.

Además, siempre hay que cubrir la placa con los pocillos para evitar cualquier contaminación o evaporación durante el período de incubación. A la hora de incubar, se debe seguir el protocolo o inserto del procedimiento que indica si se debe subir la temperatura a 37 °C o mantenerla a temperatura ambiente. El objetivo principal es mantener el medio ambiente lo más estable y consistente posible, para obtener excelentes resultados.

La importancia de reactivos de alta calidad

Ahora tiene las herramientas necesarias para realizar correctamente los inmunoensayos por ELISA. También hemos creado un artículo sobre los 11 errores más comunes en ELISA y sus posibles soluciones.

A parte de la técnica utilizada por el laboratorista, la calidad de los reactivos es de suma importancia para obtener resultados confiables. En ReactLab somos importadores exclusivos de la marca de reactivos para ELISA Monobind y más de 350 laboratorios clínicos en Ecuador utilizan los productos cada día.

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Vinicio Contreras - Jefe de Línea de productos de inmunoensayo y pruebas rápidas
Vinicio Contreras
Jefe de Línea - Inmunoensayo
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Vinicio tiene lleva más de 5 años con ReactLab y trabajaba antes como Coordinador de Banco de Sangre en la Cruz Roja. Utiliza su amplio conocimiento para educar a sus compañeros y a los clientes sobre la mejor manera de usar nuestros productos.

2 Comentarios
  • Mariana
    08/07/2021 at 14:08

    Buenas tardes después de añadir el sustrato utilizan una caja especial para guardar la placa durante el tiempo de incubación? Gracias !!

    • ReactLab
      12/07/2021 at 16:36

      Buenas tardes estimada Mariana,
      No hay una caja especial, pero dependiendo del método que utilice el fabricante se recomienda lo siguiente: si necesita oscuridad, poner en un cajón o en un espacio oscuro. Caso contrario, tapar las placas con un recorte de cartón o cartulina del tamaño de la placa para cubrirla.

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