Los 11 errores más comunes en la técnica de ELISA y sus posibles soluciones

Los 11 errores más comunes en la técnica de ELISA y sus posibles soluciones

Como laboratoristas clínicos, todos hasta cierto punto nos hemos familiarizado con la técnica de inmunoensayo por ELISA. A lo largo de los años, se ha hecho popular especialmente por su alta sensibilidad y especificidad, combinada con el bajo costo por prueba en comparación con otros métodos.

Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que, si no se ajustan correctamente, puede afectar los pasos sucesivos y el resultado de la prueba.

Por eso hemos creado esta guía con los 11 errores o problemas más comunes en la técnica de ELISA y sus posibles soluciones.

Variaciones en resultados

Fondos altos

Contaminación de los reactivos
Ejecutar la prueba de nuevo con reactivos nuevos asegurándose de evitar la contaminación durante la dispensación

Etapa de lavado insuficiente
Repita el paso de lavado. Asegúrese que los pozos se llenen por completo, pero que no lleguen al desbordamiento. Considere también aumentar del número de etapas de lavado

Leer la placa después de los 30 minutos

Error técnico o del instrumento automatizado
Vuelva a ejecutar la prueba

Olvido de lectura a tiempo por parte del operador puede causar que el producto final de la reacción de la enzima pueda precipitar y causar errores
Vuelva a ejecutar la prueba

Mala reproducción

Las huellas dactilares
Limpie la superficie inferior de la placa con agua destilada y seque antes de volver a medir

Error de dispensación
Compruebe el instrumento dispensador (automático) o la técnica de pipeteo

Se observan burbujas en los pozos
Use un alfiler, aguja o punta nueva para estallar las burbujas

Variaciones en los análisis

Interrupción(es) durante el ensayo de ELISA
La puesta en marcha de los ensayos debe estar libre de interrupciones y terminar en el menor tiempo posible, manteniendo una buena técnica. Para evitar cualquier demora/interrupción durante el proceso de un ensayo, se debe preparar todos los reactivos y muestras antes de comenzar el ensayo.

Los reactivos/muestras no están a temperatura ambiente
Dispense muestras/reactivos sólo cuando todos están a temperatura ambiente para evitar la variación de la temperatura a través de los pocillos de la placa

Coloración de reactivos

Reactivo stop mantiene una coloración azul-amarilla

Esta es una observación normal. No se mezclaron bien el reactivo de parada con el reactivo de la placa
Agite la placa con la mano o con un mixer para mezclarsuficientemente los reactivos y obtener un color amarillo uniforme

Coloración azul del sustrato

El sustrato “A” se torna de coloración azul
Sustrato contaminado. Obtenga un sustrato nuevo “A”. El sustrato “A” debe ser transparente

El sustrato “A+B” se torna de coloración azul una vez mezclado
Contaminación del sustrato. Obtenga un nuevo reactivo “A” y “B”

Controles y calibradores

Absorbancias altas de los calibradores que salen de los límites

La temperatura de la habitación puede ser superior a 30 °C o la placa se volteó durante la incubación
No agitar, girar o calentar la placa durante la incubación. Puede medir la absorbancia a una longitud de onda primaria de 405 nm debido a la constante de extinción inferior

El tiempo de incubación de la etapa de sustrato o reactivo(s) fue más largo que el especificado
Puede medir la absorbancia a 405 nm debido a la constante de extinción inferior

Valores de controles fuera de los rangos

Contaminación de los controles y calibradores
Ejecute la prueba de nuevo con nuevos controles y calibradores

Valores de calibradores y controles incorrectos
Revise los valores en los frascos o en el certificado de análisis. En el inserto de los controles y calibradores solo vienen valores de ejemplo

Absorbancias anormales

Las muestras dan absorbancias por encima de los valores de los calibradores

La concentración de la muestra es demasiada alta
Diluya la muestra con el calibrador “0” y ejecute el ensayo de nuevo

Absorbancias altas en toda la placa

Etapa de lavado insuficiente
Repita la etapa de lavado. Asegure que los pozos se llenen por completo

Contaminación de reactivo sustrato
Obtenga reactivos nuevos y compruebe la calibración de la pipeta para una dispensación adecuada

Absorbancias bajas

El volumen de reactivo es bajo
Verifique el buen funcionamiento de la pipeta y su calibración

Aumento de la humedad en la placa
Asegúrese que los pocillos no utilizados se sellen adecuadamente en la bolsa con el desecante

La prueba se analizó usando la longitud de onda incorrecta
Revise la parametrización del equipo y la longitud de la onda con la que se realizó la lectura. Se debe referir al inserto

La combinación de los sustratos (A + B) no fue preparado correctamente
Preparar reactivo sustrato mezclando los volúmenes correctos y revisando que la coloración sea transparente

La temperatura de la habitación puede ser inferior a 20 °C
Aumente el tiempo de incubación del sustrato sin exceder los 30 minutos, o llévelo a una temperatura ambiente de 20-24 °C

Etapas de lavados muy extensas
Si se ocupa un equipo de lavado automático, reduzca la presión del dispensado del equipo. Si el lavado es manual, procure que el remojo de los pocillos no sea demasiado extenso ni que esté realizando más lavados de los necesarios

Teniendo estos 11 errores y sus posibles soluciones en mente, estamos seguros de que tiene ahora el conocimiento para prevenir y/o corregir la gran mayoría de problemas que pueda manifestarse durante la realización de sus pruebas de ELISA.

Hemos creado también otro artículo en el cual puede conocer las recomendaciones generales para la realización adecuada de las pruebas de inmunoensayo por ELISA.

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Vinicio Contreras - Jefe de Línea de productos de inmunoensayo y pruebas rápidas
Vinicio Contreras
Jefe de Línea - Inmunoensayo
v.contreras@reactlab.com.ec +593 98-723-1923

Vinicio tiene lleva más de 5 años con ReactLab y trabajaba antes como Coordinador de Banco de Sangre en la Cruz Roja. Utiliza su amplio conocimiento para educar a sus compañeros y a los clientes sobre la mejor manera de usar nuestros productos.

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