Los 11 errores más comunes en la técnica de ELISA y sus posibles soluciones
Como laboratoristas clínicos, todos hasta cierto punto nos hemos familiarizado con la técnica de inmunoensayo por ELISA. A lo largo de los años, se ha hecho popular especialmente por su alta sensibilidad y especificidad, combinada con el bajo costo por prueba en comparación con otros métodos.
Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que, si no se ajustan correctamente, puede afectar los pasos sucesivos y el resultado de la prueba.
Por eso hemos creado esta guía con los 11 errores o problemas más comunes en la técnica de ELISA y sus posibles soluciones.
Variaciones en resultados
Fondos altos
Contaminación de los reactivos
Ejecutar la prueba de nuevo con reactivos nuevos asegurándose de evitar la contaminación durante la dispensación
Etapa de lavado insuficiente
Repita el paso de lavado. Asegúrese que los pozos se llenen por completo, pero que no lleguen al desbordamiento. Considere también aumentar del número de etapas de lavado
Leer la placa después de los 30 minutos
Error técnico o del instrumento automatizado
Vuelva a ejecutar la prueba
Olvido de lectura a tiempo por parte del operador puede causar que el producto final de la reacción de la enzima pueda precipitar y causar errores
Vuelva a ejecutar la prueba
Mala reproducción
Las huellas dactilares
Limpie la superficie inferior de la placa con agua destilada y seque antes de volver a medir
Error de dispensación
Compruebe el instrumento dispensador (automático) o la técnica de pipeteo
Se observan burbujas en los pozos
Use un alfiler, aguja o punta nueva para estallar las burbujas
Variaciones en los análisis
Interrupción(es) durante el ensayo de ELISA
La puesta en marcha de los ensayos debe estar libre de interrupciones y terminar en el menor tiempo posible, manteniendo una buena técnica. Para evitar cualquier demora/interrupción durante el proceso de un ensayo, se debe preparar todos los reactivos y muestras antes de comenzar el ensayo.
Los reactivos/muestras no están a temperatura ambiente
Dispense muestras/reactivos sólo cuando todos están a temperatura ambiente para evitar la variación de la temperatura a través de los pocillos de la placa
Coloración de reactivos
Reactivo stop mantiene una coloración azul-amarilla
Esta es una observación normal. No se mezclaron bien el reactivo de parada con el reactivo de la placa
Agite la placa con la mano o con un mixer para mezclarsuficientemente los reactivos y obtener un color amarillo uniforme
Coloración azul del sustrato
El sustrato “A” se torna de coloración azul
Sustrato contaminado. Obtenga un sustrato nuevo “A”. El sustrato “A” debe ser transparente
El sustrato “A+B” se torna de coloración azul una vez mezclado
Contaminación del sustrato. Obtenga un nuevo reactivo “A” y “B”
Controles y calibradores
Absorbancias altas de los calibradores que salen de los límites
La temperatura de la habitación puede ser superior a 30 °C o la placa se volteó durante la incubación
No agitar, girar o calentar la placa durante la incubación. Puede medir la absorbancia a una longitud de onda primaria de 405 nm debido a la constante de extinción inferior
El tiempo de incubación de la etapa de sustrato o reactivo(s) fue más largo que el especificado
Puede medir la absorbancia a 405 nm debido a la constante de extinción inferior
Valores de controles fuera de los rangos
Contaminación de los controles y calibradores
Ejecute la prueba de nuevo con nuevos controles y calibradores
Valores de calibradores y controles incorrectos
Revise los valores en los frascos o en el certificado de análisis. En el inserto de los controles y calibradores solo vienen valores de ejemplo
Absorbancias anormales
Las muestras dan absorbancias por encima de los valores de los calibradores
La concentración de la muestra es demasiada alta
Diluya la muestra con el calibrador “0” y ejecute el ensayo de nuevo
Absorbancias altas en toda la placa
Etapa de lavado insuficiente
Repita la etapa de lavado. Asegure que los pozos se llenen por completo
Contaminación de reactivo sustrato
Obtenga reactivos nuevos y compruebe la calibración de la pipeta para una dispensación adecuada
Absorbancias bajas
El volumen de reactivo es bajo
Verifique el buen funcionamiento de la pipeta y su calibración
Aumento de la humedad en la placa
Asegúrese que los pocillos no utilizados se sellen adecuadamente en la bolsa con el desecante
La prueba se analizó usando la longitud de onda incorrecta
Revise la parametrización del equipo y la longitud de la onda con la que se realizó la lectura. Se debe referir al inserto
La combinación de los sustratos (A + B) no fue preparado correctamente
Preparar reactivo sustrato mezclando los volúmenes correctos y revisando que la coloración sea transparente
La temperatura de la habitación puede ser inferior a 20 °C
Aumente el tiempo de incubación del sustrato sin exceder los 30 minutos, o llévelo a una temperatura ambiente de 20-24 °C
Etapas de lavados muy extensas
Si se ocupa un equipo de lavado automático, reduzca la presión del dispensado del equipo. Si el lavado es manual, procure que el remojo de los pocillos no sea demasiado extenso ni que esté realizando más lavados de los necesarios
Teniendo estos 11 errores y sus posibles soluciones en mente, estamos seguros de que tiene ahora el conocimiento para prevenir y/o corregir la gran mayoría de problemas que pueda manifestarse durante la realización de sus pruebas de ELISA.
Hemos creado también otro artículo en el cual puede conocer las recomendaciones generales para la realización adecuada de las pruebas de inmunoensayo por ELISA.
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por Vinicio Contreras
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